Detekce antimikrobiální rezistence u původců sexuálně přenosných infekcí
Abstrakt
Sexuálně přenosné infekce (STD) představují riziko pro veřejné zdraví, a to zejména z hlediska nárůstu antibiotické rezistence. V předkládané práci jsou shrnuty poznatky o nejčastějších původcích těchto infekcí, laboratorní diagnostice a současné epidemiologii, antimikrobiální rezistenci a jejích molekulárních mechanismech. Stanovení antimikrobiální citlivosti u většiny původců STD není v rutinní mikrobiologii možné z hlediska vysokých nebo specializovaných kultivačních nároků. Také, v současné době, z důvodu vyšší citlivosti detekce, jsou k diagnostice STD využívány metody molekulární biologie, které upozaďují provádění kultivace u Neisserie gonorrhoeae.
Experimentální část projektu si kladla za cíl detekci popsaných mechanismů rezistence v pozitivních vzorcích na přítomnost původců STD vyšetřených pomocí mutiplexové PCR. V prvním kroku bylo použito celogenomové sekvenování (WGS). Bohužel, získané sekvence obsahovaly velké množství humánních sekvencí a extrahumánní sekvence tak neposkytovaly dostatečné pokrytí pro detekci jednotlivých genů a mutací. Nedostatečné pokrytí bylo zjištěno i po odstranění části humánní DNA ze vzorku pomocí saponinu a tritonu-X. Vzhledem k nevhodnosti WGS jsme optimalizovali a zavedli dříve popsané metody cílově specifické molekulární detekce nejčastějších mechanismů rezistence u N. gonorrhoeae. První metodou je PCR amplifikace s analýzou křivek tání (HRM). Jako referenční metodu k HRM jsme použili Sangerovo sekvenování šesti genů (penA, mtrR, ponA, porB, 23S rRNA, gyrA).
V průběhu řešení práce byly optimalizovány teplotní profily pro PCR amplifikaci jednotlivých genů. Pro úplné pokrytí sekvenovaného úseku DNA (genu) dále bylo nutné navrhnout doplňující sekvenační primery. Pro klinické použití HRM pro detekci mechanismů rezistence u N. gonorrhoeae je nutné metodu ověřit na vzorcích DNA s identifikovanými mechanismy rezistence pomocí sekvenování jednotlivých fragmentů, které bylo v předložené práci optimalizováno.