Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb s důrazem na potenciální patogeny - Kaňková, Hana (Jihočeská univerzita, 2015)
Jako cíle práce jsem si zvolila: vypracování literární rešerše, která bude zaměřena na volně žijící améby jako patogeny lidí a zvířat, molekulární charakterizaci vybraných sbírkových kmenů améb, kdy získám sekvence genů využívaných jako markery pro tyto organismy (SSU rDNA, ITS). Data získaná sekvenací fylogeneticky analyzovat a výsledky analýz interpretovat. V teoretické části jsem se zabývala základní morfologií potenciálně patogenních améb (akantaméb a neglérií), jejich patogenitou a krátce i možnostmi léčby jimi způsobených onemocnění (primární amébová meningoencefalitida, granulomatózní amébová meningoencefalitida, amébová keratitida). Akantaméby i neglérie (Naegleria fowleri a různé druhy akantaméb) jsou schopny invadovat lidský organismus, zejména významná je jejich schopnost pronikat do mozku, kde mohou způsobit amébovou meningoencefalitidu (onemocnění CNS). Primární amébová meningoencefalitida (PAM) je způsobena N. fowleri. Onemocnění se vyskytuje hlavně u dětí a mladých dospělých, kteří se koupali (potápěli) v trvale oteplené vodě, v níž tento druh améby nacházíme. Améba vstupuje do těla přes nosní dutinu. PAM má rychlý průběh člověk zpravidla umírá do 7 dní od projevení se prvních příznaků. Granulomatózní amébová encefalitida (GAE) je způsobena zejména druhy rodu Acanthamoeba. Onemocnění je chronického charakteru (probíhá i několik měsíců). Nalézáme ho u imunokompromitovaných lidí (diabetes, HIV/AIDS, drogová závislost apod.) Do těla se akantaméba dostane skrz poranění a do CNS putuje hematogenní cestou. Dalším onemocněním způsobeným rodem Acanthamoeba je amébová keratitida (AK). AK je zánět rohovky. Akantaméba se do oka dostane většinou prostřednictvím nedostatečně sterilizované kontaktní čočky nebo při traumatu rohovky. Léčba chorob způsobených amébami je velmi komplikovaná a ne vždy úspěšná. Rozdíly mezi akantamébami a neglériemi se týkají několika oblastí životního cyklu, velikosti a patogenity. Na rozdíl od neglérií, které jsou schopny vytvořit 3 stádia (trofozoit, bičíkovec, cysta), akantaméby přecházejí jen mezi dvěma stádii (trofozoit, cysta). Trofozoit akantaméb (12-35 ?m) je v porovnání s tím neglériovým (15-25 ?m) o něco větší. Nejvýraznější rozdíly jsou vidět na cystách, které jsou u akantaméb nepravidelného tvaru, zatímco u neglérií kulovité a hladké. V praktické části své práce jsem se pokusila zodpovědět několik otázek, zejména blíže určit, do kterých genotypů resp. druhů patří mnou studované améby a zjistit bližší údaje o jejich potenciální patogenitě, geografickém rozšíření atp. V metodické části jsem popsala postup kultivace vybraných améb, získávání DNA, průběh PCR, elektroforézu a softwarové zpracování výsledných sekvencí. Pro kultivaci jsem používala klasický nevýživný agar a améby sklízela po jejich vizuální kontrole. Průběh PCR byl standardní s využitím specifických primerů a termocykleru. Výsledný PCR produkt jsem použila pro elektroforézu. Po vyřezání odpovídajících proužků gelu, jsem je odeslala na sekvenaci do specializované firmy (Macrogen). Výsledné sekvence jsem prohlédla a ty s kvalitním signálem zpracovala pomocí programů SeqMan, ClustalX, BioEdit. Pro fylogenetickou analýzu jsem využila programů Paup, RAxML a MrBayes. Podařilo se mi získat celkem 9 sekvencí genu pro SSU rRNA akantaméb a jednu sekvenci negleriové ITS. Pomocí fylogenetické analýzy jsem získala fylogenetické stromy, které jsem začlenila do kapitoly výsledky. Na kapitolu výsledky jsem navázala v diskusi. Nastínila jsem problém při získávání neglériových sekvencí a navrhla některá řešení. V další části diskuse jsem se věnovala podrobnější analýze fylogenetických stromů. Některé z mnou získaných sekvencí vykazují blízkou příbuznost se sekvencemi odvozenými z akantaméb izolovaných z pacientů s AK z různých oblastí světa, což naznačuje, že rozšíření některých potenciálně nebezpečných linií améb je globální. Neglériové sekvence jsou více omezeny prostředím, ale existují zde i výjimky.
Molecular characterization of selected amoeba strains with emphasis to potential pathogens
Keywords: Acanthamoeba; Naegleria; Primární amébová meningoencefalitida; Granulomatózní amébová encefalitida; PCR; Acanthamoeba; Naegleria; Primary amebic meningoencephalitis; Granulomatous amebic encephalitis; PCR