Diagnostika viru hepatitidy C pomocí molekulárně biologických metod - Jakubcová, Markéta (Jihočeská univerzita, 2013)
Hepatitida C je zánět jater vyvolaný infekcí stejnojmenným virem, který ve 25% případů končí hepatocelulárním karcinomem. V současnosti se rozeznává na 6 různých genotypů s nejméně 50 odlišnými subtypy (3). Virus hepatitidy C rychle podléhá mutacím, výsledkem je, že každý infikovaný jedinec obsahuje směs lehce odlišných variant viru. Unikají kontrole imunitního systému hostitele a z tohoto důvodu často přechází do chronicity. Kvalitativní průkaz je důležitý při zjištění přítomnosti viru, stanovení kvantity viru HCV je důležité při zahájení léčby a hlavně sledování účinnosti léčby (20). Nejčastěji vyšetřujeme krevní sérum nebo plazmu, HCV virus lze diagnostikovat přímo nebo nepřímo. Průkaz anti-HCV protilátek (nepřímý průkaz) metodou Elisa se rutinně provádí ve většině laboratoří a je to základní screening. Detekovatelné anti-HCV protilátky vznikají tři týdny až tři měsíce po primoinfekci (u každého jednotlivce je protilátková odpověď různá), test bývá v časných fázích infekce negativní (21). K průkazu viru se používají mimo jiných i molekulárně biologické metody PCR ? polymerázová řetězová reakce. Pro detekci pomocí PCR je v první fázi třeba vyizolovat virovou RNA (ribonukleovou kyselinu) z biologického materiálu. Viry RNA lze izolovat izolačními přístroji (tzv. izolátory) nebo manuálně s pomocí izolačních kitů (1). Výsledkem může být různý stupeň výtěžnosti a čistoty RNA. Ve své práci jsem používala pouze ruční kolonkovou izolaci. Po získání virové RNA následuje kvalitativní průkaz. Byla použita in house metoda - pomocí RT PCR (PCR s reverzní transkripcí) a následnou PCR se amplifikují specifické úseky virové RNA, které jsou vizualizované gelovou elektroforézou, s použitím ethidium bromidu. Používá se dvoukroková PCR. V prvním kole reakce probíhá reverzní transkripce 30 minut při 50°C, za přítomnosti RNase inhibitoru a enzymu reverzní transkriptázy dojde k přepisu RNA na cDNA, následně k namnožení úseku se specifickými primery. Toto vše je součástí jedné PCR reakce, která probíhá v přístroji tzv. termocycler za přítomnosti specifických primerů, vody, pufru, nukleotidů a specifického enzymu. Pro druhé kolo PCR Nested (zahnízděná PCR) se používají další dvě jiné specifické sekvence primerů, tato PCR se používá pro zvýšení citlivosti a specificity metody. Produkty PCR jsou vizualizované na agarózovém gelu s použitím interkalačního činidla (nejčastěji ethidium bromid) (3). Kvantitativní průkaz pro zjištění hladiny virémie se provádí pomocí real time PCR. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje průkaz a kvantifikaci produktů. Zároveň je systém schopen identifikovat potenciální PCR inhibici přítomností interní kontroly. Pro kvantifikaci se dodávají externí pozitivní kontroly, s jejichž pomocí lze určit množství viru ve vzorku. Po přidání standard o známé koncentraci do reakce vznikne kalibrační křivka, podle níž lze kvantifikovat vyšetřované vzorky (19). Ve své práci jsem porovnávala 2 izolační soupravy: a) High Pure Viral RNA Kit (Roche) - kit určený k izolaci RNA viru z biologického materiálu (sérum, plazma). V první fázi dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, několikanásobné promytí a poté k eluci RNA do vody ? k použití pro real time ? PCR (8). b) QIAamp Viral RNA mini Kit (Qiagen) ? kit je určený k izolaci virové RNA z lidské plazmy nebo séra. Nejprve dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, promytí a eluci RNA do vody - k použití pro real time ? PCR (13). Pro zjištění rozdílů v izolaci byly použity vzorky, které byly kvantifikovány pomocí real time PCR. Prokázal se rozdíl ve výtěžcích RNA mezi výše uvedenými soupravami. Vzorky izolované soupravou QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen) vykazovaly po kvantifikaci vyšší hodnoty naměřené virové RNA.
The diagnostics of the hepatitis C virus with usage of methods of the molecular biology
Keywords: Hepatitida C; PCR; Kvalitativní průkaz; Kvantitativní průkaz; Hepatitis C; PCR; Qualitative confirmation; Quantitative confirmation