Rezistence na aktivovaný protein C - Blatníková, Kateřina (Jihočeská univerzita, 2014)
Trombofilií označujeme vrozený nebo získaný stav organismu, při kterém je zvýšené riziko vzniku žilní trombózy. Tato život ohrožující komplikace se u nositelů trombofilního rizika objevuje v porovnání s ostatní populací významně častěji, zejména v období tzv. přídatných rizik imobilizace končetin po úraze, gravidita, užívání hormonální antikoncepce, operace a imobilizující onemocnění, delší cesty letadlem. V současné době jsou běžně k dispozici preparáty, které mohou riziko trombózy v těchto obdobích snížit. Je ale potřeba, aby nositel rizika o jeho přítomnosti věděl a mohl mu tak předcházet, nebo toto riziko mohl alespoň zmenšit. Screening rizikových osob je proto zcela klíčový. K těmto účelům slouží mnohá vyšetření. V praxi jsou nejčastěji používány funkční a molekulárně genetické testy, kterými se budu zabývat ve své práci. Jejich porovnáním a porovnáním výsledků, které těmito metodami získáváme. Metodický díl mé bakalářské práce jsem tvořila v Klinické laboratoři Oblastní nemocnice Kladno a.s., na pracovním úseku koagulace. Vzorky krve jsem získávala z rutinního provozu této laboratoře, kde jsem zaměstnána. Vzorky jsem vyhledávala mezi nově příchozími pacienty, u nichž byla odhalena rezistence na aktivovaný protein C a následně i Leidenská mutace na základě preventivního vyšetření tak i mezi pacienty kteří byli sledováni na základě rodinné anamnézy. Data mnou naměřená, jsem zanášela do tabulky spolu s výsledky naměřenými metodou PCR a porovnávala jsem je. Tato práce obsahuje popis funkčního vyšetření prováděného Klinickou laboratoří Oblastní nemocnice Kladno a.s. Preanalytickou fázi, metodiku, popis samotného analyzátoru Sysmex CA 1500 firmy Siemens, který provádí měření na principu optické metody, kdy červené světlo prochází kyvetou obsahující vzorek s reagencií a detekuje tak změnu v rozptylu světla. Dále pak popisuje užívané reagencie včetně postupu jejich přípravy před použitím, tak i jejich skladování. Všechny tyto mnou uvedené postupy jsem vedla podle standardních operačních postupů (SOP), kterými se Klinická laboratoř řídí a které byly schváleny auditem. Vyšetřovací metodu PCR jsem popsala na základě konzultací s MUDr. Václavem Maťoškou a mé krátkodobé stáže v Laboratoři molekulární diagnostiky nemocnice na Homolce a též za spolupráce s Ing. Jaroslavou Hájkovou z Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Principem PCR je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA, ve směru 5´- 3´, prostřednictvím DNA polymerázy. Tento proces spočívá ve třech krocích a v požadovaném množství cyklů. Každý z těchto kroků probíhá za určité teploty. Pro tyto účely se používá tzv. termocykler, což je přístroj konstruovaný tak, aby byl schopen měnit teplotu v požadovaných intervalech a to v těchto krocích: Denaturace- během této fáze je DNA postupně zahřívána až na teplotu vyšší než 92°C, většinou 94-95°C, kdy se rozpadnou vodíkové můstky pojící k sobě komplementární vlákna DNA. Hybridizace - Dochází k nasednutí primerů a jejich hybridizaci s jednotlivými vlákny DNA. To probíhá za teploty snížené na hodnotu v rozmezí 50-65°C. Elongace (extenze, syntetická fáze) - pro syntézu nových řetězců je třeba teploty 65 75 °C v závislosti na použité DNA polymeráze. Obvyklá je teplota 72°C. Po porovnání mnou naměřených výsledků s výsledky molekulárně genetických testů (PCR) jsem došla k závěru, že funkční testy používané v naší laboratoři jsou dostatečně citlivé k odhalení rezistence na aktivovaný protein C a tím i poukázání na Leidenskou mutaci.
Resistance to activated protein C
Keywords: rezistence na aktivovaný protein C; Leidenská mutace; trombifílie; Resistance to activated protei C; Leiden mutation; Trombophilia