Obsah metabolitů ve spermiích ryb za různých fyziologických podmínek

Abstract

Výzkum zapojení kreatinfosfátu a adenosyl fosfátů do metabolismu rybích spermií je pro spermatologii ryb vemi důležitý. Tyto sloučeniny jsou nezbytné k navození normálního fyziologického stavu a motility spermií. Souběžně probíhající změny obsahu kreatinu a adenylovaných fosfátů v rybích spermiích před a během motility nejsou zcela objasněny. Proto je velmi důležité studovat a vyvíjet nové metody kvantifikace kreatinu a adenylovaných fosfátů ve spermiích různých druhů ryb za fyziologických podmínek, jako je zrání a manipulace in vitro. Jedním ze studijních výstupů je vyvinutá metoda LC/HRPS (kapalinová chromatografie spojená se skenem produktů ve vysokém rozlišení) pro analýzu obsahu kreatinu a adenylovaných fosfátů v rybních spermiích (kapitola 2). Její hlavní výhodou je možnost detekce a kvantifikace několika sloučenin (kreatin, kreatinfosfát (CP), AMP, ADP, ATP a cAMP) současně s cílem získat maximální informace s vynaložením minimálního úsilí. Metoda byla ověřena při zohlednění takových klíčových parametrů, jako je mez kvantifikace, selektivita, výtěžnost a opakovatelnost. Představuje vynikající nástroj umožňující stanovení cílových sloučenin ve vysoce ředěných vzorcích spermatu ryb. Proto byla tato metoda použita pro kvantifikaci výše uvedených látek během procesu zrání spermií jesetera malého (Acipenser ruthenus) a při in vitro manipulaci se spermatem síha severníno mareny (Coregonus lavaretus maraena) a úhoře říčního (Anguilla anguilla). Tato studie ukázala, že nezralé spermie jesetera malého nejsou schopné iniciovat motilitu. Během jejich dozrávání bylo zjištěno průkazné snížení CP a stabilní hladiny ATP a ADP. Proto se předpokládá kritická důležitost systémů ATP regenerace a oxidativní fosforylace pro proces dozrávání spermií jesetera malého jako nezbytnosti úspěšného oplodnění (kapitola 3). Další experimenty ukázaly, že spermie úhoře říčního na počátku hormonálně indukované spermiace nebyly schopné iniciace motility aktivačním médiem (AM). Tuto schopnost však získaly ke konci hormonální stimulace. Toto doprovázelo zvýšení hladin CP a cAMP ve spermiích po aktivaci. To nám umožňuje předpokládat zapojení ATP regeneračního systému a cAMP-dependentních regulačních cest v procesu spermiace vyvolané hormonální stimulací. (kapitola 4). Současná studie představuje první úspěšné stanovení obsahu cAMP ve spermiích ryb během motility pomocí LC/HRPS. Vyvstaly důležité otázky týkající se krátkodobého uchování spermatu úhoře říčního. Obsah kreatinu, CP, AMP, ADP a ATP během krátkodobého uchování spermatu úhoře byl ovlivněn teplotou. Zjistili jsme významné snížení CP, ADP a ATP během skladování při 20 °C po jednom dni skladování na rozdíl od uchování při 4 °C. Současně se parametry motility statisticky nelišily při skladování při teplotě 4 °C a 20 °C až do sedmého dne uchování (kapitola 4). Získané výsledky by mohly přispět k rozvoji nových účinných metod pro zlepšení spermiace a krátkodobého skladování spermií v akvakulturním chovu úhoře. Různé stupně spotřeby energie v reakci na složení prostředí byly zjištěny u spermií síha severního marény. Spotřeba energie byla výrazně vyšší v podmínkách aktivace motility. V tomto procesu nebyl nalezen žádný vliv osmolality. Obsah CP a ATP byl významně vyšší, když byly buňky v médiu inhibujícím motilitu ve srovnání s aktivačním médiem. Nebyl nalezen žádný vztah mezi obsahem CP, ADP a ATP a parametry motility spermií v AM s různou osmolalitou. Izotonické podmínky upřednostňují spermie s delší dobou motility, vyšší linearitou a vyšší rychlostí bez zvýšení obsahu ATP (kapitola 5). To naznačuje, že řízení energetické účinnosti spermií síha severního marény je účinnější po aktivaci v izotonických podmínkách. Získané výsledky jsou velmi zajímavé pro přípravu nových médií pro aktivaci motility spermií pro rybářskou praxi.