Embryonální vývoj a transplantace primordiálních zárodečných buněk u candáta obecného Sander lucioperca

Abstract

Cílem této práce bylo popsat embryonální vývoj a migraci primordiálních zárodečných buněk neboli primordiálních gonocytů (PGC) a realizovat transplantaci PGC u candáta obecného. V práci popisuji několik specifických metod, jako je GFP značení a mikromanipulace s blastodiskem, které jsou nutné pro posouzení účinnosti transplantační techniky. Hlavní výsledky této práce mohou být využity pro vytvoření chimér zárodečné linie candáta obecného. Detailně jsme popsali embryonální vývoj candáta obecného až do prvního krmení při 15 °C a efekt teploty na rychlost embryogeneze při stanovení teplotních limit pro zpomalení vývoje a to s minimálními negativními důsledky na růst a míru přežití. Také jsme vyvinuli techniku změkčení chorionu candáta obecného díky použití enzymy za účelem snadného odstranění chorionu pomocí pinzet, což umožňuje detailnější pozorování. Navíc byla skupina jiker oplozena a inkubována v rozdílných teplotách za účelem zdokumentování vývojových stádií embrya, rychlosti vývoje a míry přežití. Optimální inkubační teplota, s nejvyšším oplozením, mírou přežití a mírou vykulení, byla 15°C. Embryonální vývoj byl významně zpomalen při 10 °C, s 45 % vykulených embryí (počítáno z oplozených jiker). Vývoj byl zrychlený při 20 °C, s 56 % mírou přežití oplozených embryí. Po sérii experimentů, charakterizujících embryonální vývoj candáta obecného, jsme dospěli k závěru, že pro výzkum, kde jsou požadovány flexibilní inkubační teploty, může být candát obecný z čeledi okounovitých hodnotným modelem. Popsali jsme důležité fáze časné embryogeneze, konkrétně formování žloutkové syncytiální vrstvy (YSL) a přechod midblastuly (MBT) během stádia blastuly embryí candáta. Chorion byl odstraněn způsobem popsaným v první studii. YSL se formovalo po rozpadu marginálních buněk během stádia 512 - 1 000 buněk. Následná analýza buněčného dělení pomocí barvení 4'-6'-diaminido-2-phenylindole (DAPI) ukázala, že přechod ze synchronního k asynchronnímu dělení se vyskytuje po desátém rýhování, ve stádiu 1000 buněk. Naše výsledky naznačují, že fáze MBT nastává až po tomto stádiu. Dále jsme provedli test isolace blastodisku, za účelem nalezení kompetentního stádia pro následnou embryonální manipulaci. S embryi bylo manipulováno za použití mikrojehly a mikromanipulátoru. Každou hodinu od stádia 512 buněk do stádia "sphere stage". Poté byly vyhodnoceny vývojové rychlosti ve stádiu kulení. Nejvyšší míra přežití byla získána, když provádíme tuto manipulaci v 1k-buněčné. Výsledky jasně ukazují, že embryo ve fázi MBT je nejvhodnější pro transplantaci PGC, nebo jinou manipulaci, u candáta obecného. Popsali jsme migraci PGC a provedli jsme transplantaci blastomer candáta obecného. PGC byly vizualizovány díky injikaci uměle syntetizované mRNA GFP-nos3 3'UTR. GFP-positivní PGC se objevily ve všech embryích ve stádiu přibližně 100% epiboly. Pomocí časosběrného snímání jsme popsali migrační vzor PGC od jejich počátečního objevení až po lokaci v zárodečné rýze. Během stádia blastuly jsme provedli transplantaci blastomer. Embrya donora byla značena pomocí GFP-nos3 3'UT mRNA a tetramethylrhodamine dextran pro značení PGC a somatických buněk. Vzniklo tak 12 chimér vyniklých transplantací blastomér, z nichž 8 se dožilo kulení. Ve vyvíjejících chimérách byly zřetelné dále se vyvíjející PGC a somatické buňky pocházející od donora. Transplantované PGC byly pozorovány během migrace až do usídlení v zárodečné rýze recipienta. Naše výsledky ukazují, že transplantace blastomér může být úspěšně aplikována u candáta obecného a naše výsledky mohou být užitečné pro produkci chimér zárodečné linie u okounovitých.