Účinky xenobiotik na oxidační stres, metabolizmus lipidů, integritu DNA a životaschopnost lidských buněk a rybích spermií in vitro

Abstract

Znečišťování vodního prostředí anorganickými a organickými chemikáliemi je jedním z hlavních faktorů představujících vážnou hrozbu v přežití vodních organismů včetně ryb. Proto hodnocení rizik a přínosů týkajících se konzumace ryb je v současné době intenzivně diskutované téma veřejného zdraví. Spermie téměř všech druhů ryb se před oplodněním uvolňují do vodního prostředí, kde mohou být přímo vystaveny různým sloučeninám, jako jsou například cizorodé látky zahrnující též toxické kovy. Kromě toho i samotná expozice dospělých jedinců různým škodlivinám by mohla ovlivnit kvalitu rybích gamet, jejímž následkem bude snížená oplozovací schopnost a oplodnění samotné. Mimo jiné výhody konzumace ryb jsou dobře známé, a to nejen jako bohatého zdroje bílkovin a dalších nezbytných živin, ale rovněž i mnoha zdravotních výhod. Věda a výzkum v posledních několika desetiletích ukázaly, že živiny, zejména n-3 mastné kyseliny (MK), vyskytující se u ryb a mořských plodů, jsou prospěšné pro funkci srdce a nezbytné pro vývoj mozku. Celá práce byla založena na hodnocení dvou rozdílných typů modelových buněk. Za prvé lidské jaterní buňky (Hep G2, ATCC), které byly použity jako nástroj pro studium cytotoxicity kadmia (Cd2+) in vitro formou simulace po požití kontaminované ryby a následné změny ve složení mastných kyselin a fosfolipidových tříd. Za druhé byly pro studium účinků potenciálně nebezpečných xenobiotik vyskytujících se ve volných vodách použity jako in vitro model spermie jednoho ohroženého druhu ryby, jesetera malého (Acipenser ruthenus). Spermie jesetera malého byly vystaveny po dobu 2 hod při 4 °C koncentracím xenobiotik vyskytujících se v životním prostředí. Jmenovitě u DQ (0-150 µM), TBBPA (0-10 µg.L-1) a BPA (0-10 µg.L-1) byly analyzovány funkční parametry spermií (hybnost a rychlost), hodnocena míra poškození DNA (commet test), indexy oxidačního stresu (TBARS a CP), antioxidační odezvy (SOD aktivita) a v neposlední řadě i úbytek ATP. U Hep G2 buněk byla nejprve hledána vhodná netoxická koncentrace MK. U ošetřených buněk byl naměřen jak příjem MK tak i významně zvýšený podíl EPA a DHA v porovnání s kontrolní skupinou. Vzhledem k tomu, že dávky 25 µM DHA se ukázaly být pro buňky toxické, nižší koncentrace MK a to 5 µM EPA v kombinaci s 10 µM DHA (kde byl udržen poměr 1:2 MK, simulující obsah MK v rybím mase), byly stanoveny. Na metabolické úrovni, zvýšená koncentrace EPA a DHA po 24 hod. působení na buňky vedla ke zvýšení podílu kyseliny dokosapentaenové (DPA), což naznačilo jejich zvýšený metabolismus. Proto byly ověřeny i fosfolipidové třídy, kde se v důsledku přítomnosti 5 µM Cd2+ významně snížil cardiolipin (CL). Na hladině reaktivních částic kyslíku (ROS) nebyly evidovány významné změny mezi skupinami buněk vystavených MK (24 hod) a Cd2+ (24 hod), i když navýšená lipidová (TBARS) a proteinová (CP) oxidace byla zaznamenána u skupin buněk vystavených pouze dávkám Cd2+ (1 a 5 µM). Tyto výsledky naznačují, že pre-inkubace námi zvolenými MK významně snížily oxidační stres způsobený účinkem Cd2+. U rybího spermatu byla měřena rychlost spermií (µm/s) a procento pohyblivých spermií (%), které byly významně po jeho aktivaci sníženy v porovnání s kontrolou pro každé zvolené xenobiotikum. Míra poškození DNA vyjádřena jako % DNA v ocásku a Olive Tail moment byla vyšší, pokud byly spermie vystaveny koncentraci 2,5 µg.L-1 TBBPA nebo BPA a vyšším koncentracím těchto látek. Dále indexy oxidačního stresu, jako je oxidace lipidů (LO, měřena metodou TBARS), karbonylové deriváty proteinů (CP) a antioxidační aktivita (SOD), byly podstatně zvýšeny se stoupající koncentrací DQ, TBBPA a BPA. Získané výsledky propojující tuto práci nám daly nový pohled na účinky živin ryb a mechanismy působení xenobiotik ovlivňujících metabolismus buněk z hlediska zaměření na změny v jejich lipidových třídách a spojené s výskytem problematického oxidačního stresu.