Úloha některých proteinů při zmrazování spermatu ryb

Abstract

Poškození spermií během kryokonzervace je považováno za hlavní překážku expanze technologie uchovávání spermatu ryb. Precizní znalost kryokonzervace spermatu a kryoprotektantů s ohledem na kvalitu rybích spermií může rozšířit budoucí využívání této technologie. Pro zlepšení kvality zmrazených a rozmrazených spermií byly použity antifreeze proteiny jako kryoprotektivní látky spolu s optimalizací protokolů kryokonzervace. Nejprve byla popsána vitrifikace jako slibná kryokonzervační technika pro uchovávání rybích spermií. Tradiční vitrifikace vyžaduje prudké zmrazení/rozmrazení, malé nosiče vzorků s použitím permeabilních kryoprotektantů o vysokých koncentracích, a to k vitrifikaci jak intra, tak extracelulárních kapalin. Nicméně vitrifikace rybích spermií je nepoužitelná v praktické akvakultuře, protože se používají permeabilní kryoprotektanty s cytotoxickými účinky na buňky. Množství permeabilního kryoprotektantu však může být sníženo nebo eliminováno použitím zařízení nebo technik, které dramaticky zvyšují míru zmrazení/rozmrazení ošetřením mnohem menšího množství spermií. Vitrifikace může být tudíž vhodnější pro ryby produkující malé množství koncentrovaného spermatu, ale není vhodná u jeseterů produkujících velké množství spermií s nízkou koncentrací ve srovnání s kostnatými rybami. Dále byly využity proteomické metody pro charakterizaci proteinového profilu u spermií a v semenné plazmě a studován jejich vliv na funkci spermií při konvenční kryokonzervaci. Dále byly zkoumány změny v motilitě spermií jesetera malého během kryokonzervace. Míra motility spermií jesetera malého významně poklesla po kryokonzervaci spermatu, kdežto u čerstvých a zmrazených spermií nebyl zjištěn rozdíl v průměrné nelineární rychlosti. Změna v proteinovém profilu po zmrazení byla zaznamenána celkem u šesti proteinů v semenné plazmě a u třinácti v případě spermatu. Mezi nimi bylo pozitivně identifikováno osm proteinů: a) dva (mitochondriální podjednotka ATP syntházy alfa a protein tepelného šoku 70) pocházející ze semenné plazmy, spojené s metabolismem a odpovědí na stres; b) čtyři (triosefosfát izomeráza, mitochondriální ATP syntházová podjednotka ?, glycerol-3-fosfátdehydrogenáza [NAD (+)], enolasa B) ve spermiích se podílejí na metabolických drahách jako je glukoneogeneze a glykolýza a zajišťují účinnou energii pro pohyb spermie; c) další dva (řetězec ? tubulinu a řetězec tubulinu ?, specifický pro testes) ve spermiích jsou hlavními složkami mikrotubulů spermií, které hrají důležitou roli v organizaci cytoskeletu mikrotubulu. Dosažené výsledky rozšiřují znalosti v proteinovém složení spermatu během kryokonzervace, souvisejících s jejich poškozením během zmrazení, což může pomoci určit funkci těchto změněných proteinů a poskytnout nové představy o tom, jak zlepšit kryokonzervaci spermií. Je známo, že kryokonzervace způsobuje letální a subletální poškození spermií, proto byly dále použity během kryokonzervace různé koncentrace antifreeze nemrznoucích proteinů (AFPI nebo AFPIII) jako kryoprotektantů. Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že přidáním nemrznoucích proteinů došlo významně ke zlepšení membránové integrity spermatu jeseterů malých po kryokonzervaci s výjimkou koncentrace 0,1 ?g/ml AFPI. Ve zmrazených spermiích s přídavkem nemrznoucích proteinů však nebylo pozorováno žádné statistické zlepšení rychlosti motility, nelineární rychlosti, lineární rychlosti a fertility ve srovnání se spermiemi bez přídavku nemrznoucích proteinů. Z toho vyplývá, že přidávání nemrznoucích proteinů do kryokonzervačního média poskytuje určité ochranné účinky integritě plazmatické membrány spermií.