Použití CRIPR/Cas9 a nové techniky značení zárodečných buněk pro náhradní reprodukci u jeseterů

Abstract

Jeseteři, obvykle také známí jako žijící fosilie, nebo starověcí giganti, se odštěpili od starověké pre-Jurské line kostnatých ryb přibližně před 300 miliony let. Osmdesát pět procent druhů jeseterů je podle Mezinárodního svazu ochrany přírody (IUCN) řazeno mezi kriticky ohrožené. Charakteristiky reprodukce jeseterů, jako například pozdní pohlavní dospělost a periodicky přerušovaný reprodukční cyklus komplikuje jejich obnovu. Jeseter malý (Acipenser ruthenus) patří k jeseterům s nejkratší dobou dospívání. Proto by mohl být použit jako recipient pro náhradní reprodukci jeseterů. Dead end gen (dnd1) byl objeven jako maternální RNA se specifickou expresí výhradně v zárodečné linii obratlovců. Různé studie potvrdily, že protein Dnd1 je nezbytný pro migraci primordiálních gonocytů (PGC) a že narušení migrace PGC ovlivňuje plodnost ryb. PGC u zebřičky pruhované deficientní na Dnd1 protein se transdiferencují do somatických buněk. Naši kolegové v minulosti využili antisense morfolino oligonukleotid (MO) způsobující knock-down dnd1 u jesetera malého, aby produkovali recipienty bez zárodečných buněk pro techniku náhradní reprodukce. CRISPR / Cas9, technologie pro úpravu genomu, se používá v různých oblastech výzkumu; zde jsme se proto snažili využít možnosti výše zmíněné technologie ke knock-outu dnd1 u jesetera malého. U embryí injikovaných CRISPR/Cas9 byl pozorován nulový, nebo menší počet PGC ve srovnání s kontrolní skupinou injikovanou pouze fluorescein isothiocyanatem konjugovaným s dextranem (za účelem značení PGC). Dále jsme srovnávali tři různé techniky: CRISPR/Cas9, UV záření a MO. Naše údaje ukázaly vyšší míru vykulení a přežití ve skupinách CRISPR/Cas9, následovalo UV a jako poslední MO. Je zajímavé, že některá embrya ošetřená CRISPR/Cas9 vykazovala malformace, předpokládáme tedy, že malformace byly způsobeny účinky off-targetu a/nebo v důsledku dvojitých injikací, tj. injikací CRISPR/Cas9 do animálního pólu a FITC-dextran do vegetativního pólu. Vzhledem k výhodám aplikace nanočástic v různých rozvíjejících se výzkumných oborech jsme se rozhodli je použít ke značení PGC u jeseterů. Injikovali jsme nanočástice oxidu železa v kombinaci s FITC-dextranem do vegetativního pólu embryí a úspěšně jsme takto PGC označili. Injikace nanočástic do jeseterů neovlivnila míru vylíhnutí a přežití embryí. Je zajímavé, že 5 dní po oplození bylo ve skupině injikovaných s FITC-dextranem a nanočásticemi pozorováno signifikantně nižší množství značených PGC ve srovnání s PGC, které byly označeny pouze FITC-dextranem. Jedná se o první studii svého druhu, ve které byly zárodečné buňky označeny nanočásticemi. Tato práce poskytuje informace o úloze proteinu Dnd1 jako potenciálního molekulárního markeru zárodečných buněk u různých druhů ryb a jeho využití pro ochranu ohrožených i kriticky ohrožených druhů ryb. Dnd1 knock-out u jesetera malého může být potenciálně použit jako metoda pro vytvoření sterilního hostitele pro náhradní reprodukci jeseterů. Navíc značení PGC u jeseterů pomocí nanočástic může otevřít nové cesty ke studiu interakce nanočástic s buňkami, které mohou v kombinaci s hypertermií, při které jsou buňky nebo tkáně vystaveny elektromagnetickému poli způsobujícímu lokální zvýšení teploty, aktivovat buněčnou smrt. Po vložení nanočástic do PGC embrya jesetera by mohlo být možné izolovat PGC pomocí magnetu nebo aplikovat hypertermii pro účely sterilizace recipientů.