Využití cytometrických metod k rozeznání mezidruhových hybridů jeseterů od jeseterů čistého druhu

Abstract

Cílem této diplomové práce je porovnání obsahů DNA naměřených průtokovou a obrazovou cytometrií k rozeznání čistých jeseterovitých druhů ryb (Acipenser ruthenus, A. baerii, A. gueldenstaedtii) a uměle vytvořených mezidruhových F1 hybridů (A. ruthenus x A. baerii, A. baerii x A. ruthenus, A. baerii x A. gueldenstaedtii, A. gueldenstaedtii x A. baerii) pocházející z uzavřeného chovu Genetického rybářského centra VÚRH ve Vodňanech (FROV JU). K měření relativního obsahu DNA pomocí průtokové cytometrie (FCM) byly vzorky ploutevní tkáně barveny fluorescenčním barvivem DAPI (4,6-diamidin-2-phenylin-dolem). Výsledné hodnoty relativních obsahů DNA byly přepočítány na absolutní obsah DNA. Pro obrazovou cytometrii byla zvolena metoda Feulgenovy obrazové analýzy (FIA). Stanovení absolutního obsahu DNA touto analýzou proběhlo měřením IOD (integrované optické denzity) jader erytrocytů na připravených, uložených a dosud nezpracovaných krevních nátěrech. V tomto experimentu bylo testováno měření 20 postupně analyzovaných jedinců z každé skupiny/ populace, nešlo však o identické jedince testované oběma metodami současně. Proto je možné, že u některých skupin bylo zjištěno více ploidních úrovní metodou FCM než metodou FIA a naopak. Na základě získaných výsledků měření lze říci, že využití těchto cytometrických metod k rozeznání mezidruhových F1 hybridů jeseterů od jeseterů čistého druhu pouze na základě stanovení obsahu DNA, lze jen stěží. To bylo prokázáno statistickou analýzou, díky níž byl zjištěn průkazný rozdíl (p < 0,05) pouze mezi obsahy DNA odpovídající odlišné ploidní úrovni. Z toho vyplývá, že skupina, ať už mezidruhového hybrida nebo čistého druhu s relativně stejnou hodnotou obsahu DNA odpovídající stejné ploidní úrovni se od sebe navzájem statisticky neliší (p > 0,05), nezávisle na zvolené metodě měření. Stěžejním problémem bude pravděpodobně spontánní polyploidizace či mezidruhová hybridizace. Mezi metodami nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl (p > 0,05), a proto lze do jisté míry odmítnout hypotézu s podhodnocováním výsledků naměřených metodou FCM s fluorescenčním barvivem DAPI a následného přepočtu. Avšak je-li možné pro měření obsahů DNA v praxi metodu FCM - DAPI upřednostnit před časově náročnější metodu FIA, si žádá další výzkum. Především by bylo vhodné podobný experiment zopakovat, s doporučením zařadit do metodiky také průtokovou cytometrii s fluorescenčním barvivem propidium jodid, díky níž je možné přímo měřit absolutní obsah DNA. Následně pak tyto tři cytometrické metody podrobit statistické analýze.