Isolation of early stages of germ cells in pikeperch (<i>Sander lucioperca</i>)

Abstract

Tato studie popisuje techniku enzymatické disociace a izolace raných stádií zárodečných buněk (eGC), zahrnující spermatogonie a spermatocyty candáta obecného (Sander lucioperca) (Percidae, Teleostei). Jejich potenciál diferencovat se do funkčních gamet a přenášet genetickou informaci do dalších generací z nich dělá vhodného kandidáta pro kryoprezervaci a tvorbu chimér. Pro zvolení vhodného věku pro izolaci byly testovány dvě skupiny candátů lišící se věkem (14 a 18 měsíců stáří). Díky vyšší průměrné hmotnosti gonád (0,513 g) se jako vhodnější ukázali 18 měsíční samci candáta obecného. Pro enzymatickou disociaci testes bylo použito 10 ml PBS s 0,3% trypsinu (304 mOsm/kg, pH 8). Testikulární buňky byly následně tříděny centrifugací v hmotnostním gradientu Percollu. eGCs byly identifikovány na základě jejich ploidní úrovně s použitím CYSTAIN DNA 1 kitu (PARTEC) a morfologických charakteristik s použitím světelné mikroskopie. Buňky byly počítány na histologických řezech a po použití Percoll gradientu metodou náhodných čtverců. Metoda izolace zvýšila zastoupení eGC ze 41,3% na 84,7% získané z 33% koncentrace Percollu.