Využití molekulárně biologických metod při diagnostice cytomegaloviru (CMV)

Abstract

Lidský cytomegalovirus (HCMV nebo CMV) je lidský virový patogen ze skupiny herpetických virů, které se nacházejí v rozvinutých i méně rozvinutých společnostech a u všech věkových skupin. V této práci bylo porovnáváno kvalitativní stanovení DNA CMV pomocí dvou metod PCR. Jednou z nich byla in house metoda. Zde se pomocí nested PCR se dvěma páry specifických primerů amplifikují úseky virové DNA CMV, které jsou následně detekovány na agarózovém gelu. Vizualizace takto získaných produktů PCR na agarózovém gelu se děje za pomocí interkalačního činidla ? ethidium bromidu. Tato metoda je velmi citlivá, ale časově náročná. Jako druhá metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV byla použita metoda real-time PCR na přístroji Rotor Gene. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázána na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce PCR produktů je prováděna na základě intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase. Systém je zároveň schopen identifikovat potenciální PCR inhibici za přítomnosti interní kontroly. Tato metoda se jeví jako časově výhodnější, proto byla zavedena jako běžně užívaná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV. Metody nested PCR a real-time PCR mají srovnatelnou citlivost a jsou srovnatelné i po finanční stránce. Pro jejich srovnání bylo použito 150 vzorků krve a krevní plazmy od 75 jedinců. Záchyt DNA CMV byl srovnatelný. Jen v jednom případě nebyl zachycen pozitivní výsledek u metody real-time na přístroji Rotor Gene, zatímco metoda nested PCR jej zachytila. I tak se metoda real-time PCR jeví jako velmi výhodná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV a to i díky používání interních kontrol.U pacientů po transplantacích, u novorozenců, u onkohematologických pacientů je třeba kvůli léčbě provádět kvantitativní stanovení DNA CMV. V této práci byla pro kvantitativní stanovení používána metoda real-time PCR na přístroji Light Cycler. CMV LC Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 105bp dlouhého úseku genomu CMV a také pro bezprostřední detekci amplifikátu pomocí přístroje Light Cycler. I zde se nachází amplifikační systém pro průkaz potenciální PCR inhibice založený na detekci interní kontroly. Analytický limit detekce přitom není negativně ovlivněn. Množství CMV viru ve vzorku se určuje pomocí kvantifikovaných standard, které jsou součástí kitu. Analyzátor vypočítává titr virové DNA v testovaných vzorcích porovnáním signálu u každého vzorku se signálem kvantitativního standardu, jenž je přiřazen ke kalibrační křivce daného balení kitu. Kvantitativní stanovení se pak uvádí v množství kopií/1 ml vzorku. Právě na základě monitorinku kvantitativního stanovení se u pacientů určuje délka léčby CMV infekce. Izolace DNA lze provádět ručně nebo pomocí automatických přístrojů ? izolátorů.Ve své práci jsem se zaměřila na srovnání těchto dvou odlišných izolací. Ruční izolaci jsem prováděla pomocí izolačního QIAmp DNA Mini Kitu od firmy QIAGEN. Automatizovanou izolaci jsem prováděla na izolátoru MagCore za použití MagCore Genomic DNA whole Blood Kitu (RBCBioscience). Pro srovnání obou izolací byly současně použity jako klinické materiály krev a krevní plazma vždy od stejného jedince. Obě metody izolací pak byly následně použity pro kvalitativní i kvantitativní stanovení CMV DNA. Z výsledků kvantitativních stanovení vyplývá, že obě použité izolace jsou srovnatelné, tzn. lze použít obě izolace se stejným kvantitativním výsledkem.