Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb rodu Acanthamoeba, potencionálních lidských patogenů

Abstract

Rod Acanthamoeba patří do skupiny organismů v češtině souhrnně označovaných jako měňavky. Pro člověka mohou mít tyto améby fatální následky, dostávají se do těla člověka např. přes kůži, následně jsou krevním řečištěm rozneseny po těle, kde dále parazitují a to pak především v mozku, kde způsobují málo známé onemocnění zvané granulomatózní amébová encefalitida. Toto onemocnění se nejvíce projevuje u lidí, kteří již prodělali nějaké onemocnění, jedná se například o systémový lupus erytromatodes. Granulomatozní amébová encefalitida vyvolává především zánět mozku, který poté často způsobuje nekrózu mozkové tkáně. Mezi hlavní příznaky patří bolesti hlavy, nevolnost, zvracení, afázie a ataxie. Tato práce se zabývá i dalšími amébami jako jsou: Neagleria fowleri, Balamuthia mandrillaris, Sappinia diploidea a Entamoeba histolytica. Neagleria fowleri je známá jako původce onemocnění, které nazýváme primární amébová encefalitida.Pro izolaci DNA bylo vybráno pět kmenů améb. Jako další krok jsem prováděla amplifikaci metodou PCR, která využívá střídání nižších a vyšších teplot v přístroji zvaném termocykler. Poté následovala elektroforéza, která pomocí proužků v agarozovém gelu, který jsem si vždy sama připravovala, ukázala přítomnost nebo nepřítomnost fragmentu amébové DNA. V případě úspěšnosti, tedy přítomnosti fragmentu DNA, jsem daný fragment vyřezávala skalpelem a opatrně ho přenesla do zkumavky. Následně jsem prováděla extrakci, tedy přečištění. Extrakci jsem prováděla pomocí Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit, dle návodu výrobce. Jako mezikrok před sekvenováním jsem prováděla klonování, které, jak se poté ukázalo, nebylo příliš efektivní. Co se týče samotného sekvenování, to provádí firma Seqme.Následné zpracování sekvencí jsem prováděla v programu BioEdit a alignování v ClustalX. Poté následovala tvorba fylogenetických stromů v programu PAUP a jejich vizualizace v TreeView. Na základě těchto výsledků jsem zjišťovala příbuznost améb, ukázalo se, že většina améb sice patří do hojně zastoupeného genotypu T4, ale jejich příbuznost v rámci něj nijak velká není. Co se týče klinických vzorků, které jsem měla k dispozici (oba dva z lidských očí), tak zde se vzorek O1 zařadil do genotypu T4, ale naproti tomu vzorek O2 se zařadil do genotypu T3. Dále byla vyhodnocena efektivnost používaných primerů: specifické primery AcaJDP1 a AcaJDP2 byly o hodně účinnější, než původně použité "eukaryotické" primery ERIB1 a ERIB10.