Hledání optimálních podmínek izolačního postupu pro přípravu templátového materiálu za účelem studia genové exprese mesenchymálních stromálních buněk pupečníkové tkáně

Abstract

Ribonukleová kyselina (RNA) je jednou z hlavních komponent systému regulace genové exprese, která probíhá v buňce jako odpověď na exogenní i endogenní stimuly. S rozvíjejícími se technikami molekulární biologie se stává tato molekula jedním z nejdůležitějších nástrojů pro analýzu genové exprese ve výzkumných, diagnostických i terapeutických postupech. Na rozdíl od deoxyribonukleové kyseliny má RNA velmi nestabilní charakter a proto je její izolace technicky náročnější. Pro účely studia genové exprese musí splňovat purifikovaná RNA několik parametrů, mezi nimiž je nejdůležitější čistota. Použité izolační postupy tedy musí zajistit efektivní separaci RNA od ostatních buněčných komponent i izolačních chemikálií. V současnosti se nabízí několik technik pro izolaci RNA, z nichž nejběžněji používané jsou dva typy izolace RNA kombinací guanidin thiokyanát-fenol-chloroform známá pod komerčním názvem TRIzol nebo TRI Reagent a extrakce RNA na pevné fázi neboli kolonová izolace. Tato studie shrnuje základní poznatky o povaze RNA jakožto biologické makromolekuly a popisuje postupy užívané pro její extrakci z biologického materiálu. Spektrofotometrie patří k nejčastěji užívaným metodikám v medicínských a biologických laboratořích. Proto je při výběru měřících zařízení kladen důraz na rychlost, přesnost, spolehlivost a jednoduchost ovládání přístroje. Vývoj spektrofotometrických zařízení pokračuje směrem k zpřesnění měření a snížení nároků na množství měřeného vzorku. Usnadňuje tak provedení rozsáhlých studií a zpřesňuje jejich výsledek. Při používání spektrofotometrů je vhodné seznámit se s fyzikálními principy a konstrukčními dispozicemi používaných spektrofotometrů. Tyto znalosti nám mohou pomoci ke správnému použití přístroje a interpretaci získaných dat. Tato práce shrnuje fyzikální zákony a základní principy týkající se elektromagnetického záření a spektrofotometrie, studie dále nastiňuje obecné schéma konstrukce spektrofotometrů a kritické parametry pro měření koncentrace nukleových kyselin. Cílem této studie bylo nalezení optimálních metodických postupů, které by poskytly dostatečné množství kvalitní RNA pro následnou analýzu genové exprese několika desítek molekulárních markerů ve větším počtu buněčných vzorků mesenchymálních stromálních buněk. Ve studii byly porovnány běžně užívané postupy izolace RNA určené pro následnou reversní transkripci. Testované metodiky zahrnovaly izolaci RNA kombinací guanidin thiokyanát-fenol-chloroform a extrakci na pevné fázi, celkem bylo porovnáváno sedm komerčních produktů. Hodnoceným parametrem byl výtěžek a čistota izolované RNA ve vztahu k množství zdrojového biologického materiálu. Studie zahrnovala srovnání kvality měření dvou spektrofotometrických přístrojů NanoDrop ND-1000 a BioPhotometer Eppendorf v parametrech přesnosti měření koncentrace a čistoty RNA, rychlosti měření, minimálního objemu vzorku nezbytného pro měření a výpovědní hodnoty výstupních dat přístroje. Srovnávací experimenty byly provedeny na sadě buněčných vzorků obsahujících různý počet mesenchymálních stromálních buněk a na komerčně získané purifikované RNA. Výsledky studie ukázaly, že v případě vzorků s malým množstvím zdrojového materiálu poskytuje technika extrakce RNA na pevné fázi kvalitnější RNA než izolace roztokem TRI Reagent. Z porovnávaných izolačních postupů vykazovala nejvyšší výtěžky i čistotu RNA souprava ZR RNA MicroPrep. Při porovnání spektrofotometrických přístrojů vykazoval přístroj NanoDrop lepší hodnoty všech posuzovaných parametrů; menší chybu a kratší dobu měření, spotřebu menšího množství vzorku pro měření a získání dat s větší výpovědní hodnotou. V souhrnu byl pro plánovanou analýzu genové exprese zvolen izolační postup soupravou ZR RNA MicroPrep doplněný kvantifikací RNA pomocí spektrofotometru NanoDrop.