Zavedení vyšetření mutace V600E v genu BRAF v klinické laboratoři

Abstract

Rakovina kůže patří v dnešní době k velmi častým nádorovým onemocněním. Dokázáno je, že slunce a rakovina kůže spolu maximálně souvisí, a tak může postihnout kohokoliv, ale vyšší náklonnost vykazují lidé "světlých typů" s blonďatými nebo zrzavými vlasy, světlou kůží a velkým množstvím pih. Nejčastější lokalizace kožních nádorů je na místech, která jsou dlouhodobě vystavená slunečnímu záření oční víčka, nos, tváře, šíje, ramena a ruce. Nejčastějšími druhy rakoviny kůže jsou bazaliom, melanom a spinaliom. Cílem mé bakalářské práce bylo osvojení si teoretických poznatků ohledně rakoviny kůže, především o maligním melanomu. Maligní melanom se na rozdíl od ostatních epiteliálních nádorů jako je bazaliom nebo spinaliom nevyznačuje lokálním destruktivním růstem, ale nebezpečím časného hematogenního nebo lymfogenního metastazování. Maligní melanom metastázuje nejčastěji do lymfatických uzlin, ale vzdálené metastázy se mohou objevit i v kůži, plicích, mozku a gastrointestinálním traktu, převážně v tenkém střevě. Za biologickou příčinu maligního melanomu můžeme považovat přítomnost mutací. Jednou z nejvýznamnějších a nejvíce popisovaných mutací v souvislosti s maligním melanomem je mutace genu BRAF V600E, která se vyskytuje v pozici 1799 v oblasti kodonu 600. Mutace kodonu GTG>GAG vede k záměně valinu za kyselinu glutamovou. Aktivace mutovaného BRAF proteinu je výsledkem konformačních změn v jeho struktuře. Mutované V600E BRAF buňky nepodléhají apoptóze a stárnutí, což má za následek nekontrolovatelný replikační potenciál buněk. V600E BRAF mutovaný melanom pak uniká imunitní odpovědi organismu. V praktické části mé bakalářské práce bylo cílem osvojit si základní molekulárně biologické metody v genetické laboratoři. Především izolaci genomové DNA z bukálního stěru i periferní krve, přípravu a provedení PCR reakce, přípravu agarózového gelu a detekci PCR produktů pomocí gelové elektroforézy. Vyšetření mutace V600E v genu BRAF jsem prováděla pomocí metody PCR-ARMS. Principem této metody je použití čtyř různých primerů schopných detekovat mutovanou i nemutovanou sekvenci DNA během jednoho experimentu. Metodika byla převzata z práce Huang et al. (2013) a následně upravena pro potřeby laboratoře.