Manipulace zárodečných buněk jako nástroj pro management a produkci izogenních linií u ryb
Abstrakt
Izogenní linie ryb představují základní možnost kontroly genetického pozadí pokusných organismů, jelikož všichni jedinci z dané izogenní linie sdílejí stejný genotyp. Izogenní linie ryb byly dosud produkovány pouze opakovanou uniparentální dědičností - androgenezí a gynogenezí. V první generaci je produkováno homozygotní potomstvo, následně každý homozygotní jedinec po opětovné indukci uniparentální dědičnosti produkuje odlišnou izogenní linii. Navzdory optimalizovaným postupům pro indukci uniparentální dědičnosti byly izogenní linie úspěšně produkovány pouze u několika druhů ryb. Jejich dlouhodobé udržování je značně problematické z důvodu nízké životaschopnosti a nepříznivých reprodukčních charakteristik. Situace je dále komplikována tím, že izogenní linie jsou zpravidla přirozeně monosexní, kdy pro další reprodukci je nutné znovu použít uniparentální dědičnosti, nebo provést zvrat pohlaví u části jedinců.
V této dizertační práci bylo provedeno několik typů manipulací se zárodečnými buňkami. Byly vyvinuty a optimalizovány protokoly pro kryokonzervaci spermatogonií a oogonií za účelem maximalizace jejich životaschopnosti po rozmrazení. Fyziologická aktivita kryoprezervovaných buněk byla potvrzena transplantací do náhradního hostitele. Kryoprezervované a následně transplantované buňky si v porovnání s nezamraženou kontrolou zachovaly srovnatelnou kolonizační aktivitu, byly schopny se transdiferenciovat ze spermatogonií na oogonie. Úspěch transplantace byl následně potvrzen detekcí exprese genů spojených s gametogenezí u kapra pomocí RT-PCR.
V další studii byly zárodečné buňky z homozygotních donorů kapra obecného transplantovány do náhradních rodičů - karas obecný zlatá forma, kteří byli sterilizováni pomocí tlumení exprese genu zodpovědného za vývoj a migraci zárodečných buněk. Tento postup má potenciál zvýšit šanci na produkci životaschopný gamet. Zárodečné buňky homozygotů s různým stupněm poškození gameteogeneze mohou být přeneseny do plně životaschopných hostů a tím celkově zvýšit efektivitu produkce izogenních linií. Použití karase zlatého jakožto náhradního rodiče navíc zajistí, že část chimér zárodečné linie budu samci a část samice, tím pádem budou produkovány gamety obou pohlaví a pro další reprodukci izogenní linie nebude nutné dalších zásahů, které jsou běžně nutné pro udržitelnost izogenní linie.
Vhodnost triploidních recipientů pro transplantaci zárodečných buněk, kteří mohou být potenciálně použity jako recipienti pro buňky z homozygotů za účelem produkce izogenních linií, byla potvrzena u kaprovitých ryb na modelu dánia pruhovaného. Spermatogonie a oogonie z diploidních donorů byly transplantovány do uměle indukovaných triploidních larev. Po dosažení pohlavní dospělosti byly získány spermie původem z transplantovaných buněk donora. Oogonie se transdiferenciovaly do spermatogonií a byly produkovány spermie s pohlavními chromozomy samic, které mohou být zajímavé pro další studie determinace pohlaví u dánia pruhovaného.
Dále byla vyvinuta nová technika pro přenos zárodečné linie linií byla vyvinuta s použitím embryí dánia pruhovaného. Buňky dárce byly transplantovány ze stádia blastuly do rozplavaných larev. S tímto přístupem byly nediferencované primordiální zárodečné buňky schopny kolonizovat genitální rýhu a zahájit gametogenezi. Po dosažení pohlavní dospělosti chimér zárodečné linie byly získány gamety a životaschopné potomstvo. Ačkoli celková účinnost této metody byla ve srovnání s jinými transplantačními metodami nižší, tato studie může mít význam pro záchranu zárodečné linie u málo životaschopných embryí nebo letálních mutantů.