Stárnutí rybích oocytů a modifikace histonů
Abstrakt
Buněčné stárnutí oocytů je charakterizováno ztrátou funkčních schopností v průběhu času. Epigenetické změny jsou jedním z faktorů, které přispívají k procesu stárnutí oocytů. Epigenetické regulátory, jako je methylace DNA, modifikace histonů a nekódující RNA, řídí aktivitu buněčného genu bez změny základní sekvence DNA. Modifikace histonů patří mezi nejdůležitější a nejběžnější epigenetické konfigurace, které hrají klíčovou roli a významně ovlivňují úspěšnost vývoje těsně po oplození a při raném vývoji embryí. Každý oocyt obsahuje hlavní a zásadní informace, které jsou potřebné k průběhu a vývoji embryogeneze a k přestavbě rodičovských genomů. Základní molekulární procesy a dráhy způsobující stárnutí oocytů zůstávají však stále neznámé. Z tohoto důvodu je zapotřebí se nadále věnovat výzkumu, sledování a porozumění molekulárním mechanismům, které jsou zodpovědné za proces stárnutím oocytů. Tématem této disertační práce byl výzkum a sledování procesu stárnutí oocytů u ryb se zaměřením na modifikaci histonů. Vedle toho byl také sledován a zkoumán fenotyp oocytů a jejich funkční změny během stárnutí. V práci byly především využívány oocyty dánia pruhovaného (Danio rerio) jako významného modelového organismu, u kterého prozatím vliv stárnutí oocytů na ploidní abnormality embryií nebyl studován. Proto toto téma bylo součástí této práce. Ovšem především byla sledována a zkoumána modifikace histonů v molekulární analýze se zvláštním zaměřením na acetylaci histonů. Aby došlo k získání více informací o dynamice acetylace histonů během stárnutí rybích oocytů, začala být hodnocena aktivita histon acetyltransferázy.
Oocyty dánia pruhovaného, která byla uchována při 26 °C po dobu 2 hodin po jejich umělém výtěru (HPV), vykázala plnou oplozeníschopnosti bez jejich výrazného snížení. U oocytů tohoto druhu byla pozorována téměř úplná ztráta jejich životaschopnosti a oplozeníschopnosti až po 6 HPV. Kromě toho byly u všech larev, které byly získané z oocytů uchovávaných 4 a 6 HPV, pozorovány morfologické abnormality. Ve srovnání s oocyty, které byly uchovávány jen 0 a 2 HPV, byl podíl ploidních abnormálních embryí dania pruhovaného významně vyšší u oocytů uchovávaných 4 HPV. Míra přežití embryí v očních bodech a míra líhnivosti se významně snížila v průběhu postupného stárnutí oocytů u kapra obecného (Cyprinus carpio). U amura bílého (Ctenopharyngodon idella) byl pozorován významný pokles míry přežití embryí již u oocytů, které byly uchovávány 1 HPV. Specifická acetylace histonů na H3K9, H4K5 a H4K8 nevykazovala významné rozdíly u různě starých oocytů kapra obecného a amura bílého. Histony H3K14ac a H4K16ac nevykázaly žádný projev změny ani u čerstvých a ani u starších oocytů kapra obecného a amura bílého.
Histon H4K12ac výrazně zvýšil acetylaci u ocytů kapra obecného držených 28 HPV, zatímco stejný histon u oocytů amura bílého výrazně snížil acetylaci po 1 a 4 HPV. Aktivita histon acetyltransferázy (HAT) vykazovala rostoucí trend během procesu stárnutí u in vivo a in vitro držených oocytů kapra obecného. Aktivita HAT se u oocytů amura bílého výrazně zvýšila po 30 HPS. Získané výsledky týkající se acetylace histonu mají druhově specifický charakter a jsou závislé na stavu oocytu. Tyto získané výsledky jsou prvními vyýsledky, které popisují přítomnost H3K9ac, H4K5ac, H4K8ac a H4K12ac, stejně jako nepřítomnost H3K14ac a H4K16ac v metafáze II oocytech kapra obecného a amura bílého. Další výzkum zabývající se modifikací histonů a souvisejících genomových oblastí u různě uchovávaných a starých oocytů bude velmi užitečný pro další vysvětlení zákonitostí spojených s procesem stárnutím oocytů. Výzkum prezentovaný v této práci navíc naznačuje možnost potencionálně vyvinout prakticky využitelný epigenetický ukazatel kvality oocytů, který by byl schopný zhodnotit kvylitu oocytů v průběhu jejich inkubace a stárnutí před jejich oplozením.