Úloha izoenzymů v regulaci metabolismu sinic
Abstrakt
Modelová sinice Synechocystis PCC 6803 je jedním z nejstudovanějších druhů sinic, který má významný podíl v biotechnologických aplikacích, což vysvětluje, proč se jí také říká "zelená E. coli". Experimentální studie mohou poskytnout in vitro charakterizaci isozymů, ale nikdo neví, zda a jak přesná je taková parametrizace ve srovnání se stavem in vivo. Také navzdory studiím s jedním/mnoha mutanty, stále plně neznáme rozsah rolí izoenzymů. Důvody, které stojí za tímto problémem, jsou: i) vyřazení jednoho izozymu je pravděpodobně kompenzováno zbývajícími izozymy, ii) deaktivace všech izozymu nepočítá s neznámou multifunkčností jiných enzymů nebo iii) metabolická plasticita Synechocystis umožňuje přesměrování metabolického toku na alternativní dráhy v rámci centrálního metabolismu uhlíku, např. prostřednictvím glykolytických drah (Embden-Meyerhof-Parnasova dráha, Entner-Doudorova dráha, fosfoketolázová dráha a oxidativní pentózofosfátová dráha). V této studii jsem se zaměřila na rozluštění některých regulačních mechanismů v rámci centrálního metabolismu uhlíku Synechocystis s pomocí metabolického modelu, který integruje fluxomické, metabolické a transkriptomické údaje z literatury a různých databází, např. Uniprot, KEGG.
V první polovině svého doktorského výzkumu jsem se zaměřila na vliv většinou opomíjené glykolytické fosfoketolázové dráhy. Zejména jsme ukázali, že tok uhlíku cestou fosfoketolázy může dosáhnout 250 % toku přes Embden-Meyerhof-Parnas glykolýzu za autotrofních podmínek a úrovně CO2 okolního prostředí. Tedy, fosfoketolázová dráha hraje klíčovou roli tím, že zmírňuje dekarboxylaci, tj. ztráty uhlíku, ke kterým dochází v ostatních glykolytických cestách. Dále jsme předpověděli, že role fosfoketolázové dráhy za mixotrofních podmínek je u Synechocystis spíše zanedbatelná, přestože je tato dráha klíčová u většiny bakterií za heterotrofních podmínek. Kromě toho jsme potvrdili existenci předpokládaného izoenzymu fosfoketolázy (PKET 2) a kvantifikovali následující výsledky za autotrofních podmínek a úrovně CO2 okolního prostředí: 1) 17% snížení toku přes RuBisCO pro delta pket1 a 2) 11,2-14,3% snížení růstu pro delta pket2 v turbulentním prostředí a 3) preference substrátů pro fosfoketolázovou dráhu za daných růstových podmínek.
V druhé polovině své výzkumné práce jsem se zaměřila na nedávno potvrzenou glykolytickou Entner-Doudoroffovu dráhu u Synechocystis. Entner-Doudoroffova dráha byla dříve považována za velmi běžnou ( 92 %) mezi sinicemi, ale moje bioinformatická analýza na základě dostupných zdrojů dat předpověděla, že výskyt Entner-Doudoroffovy dráhy je nižší než 50 %. Zajímavé je, že jsme také identifikovali pravděpodobné izozymy v rámci Entner-Doudoroffovy dráhy u některých sinic. V případě Synechocystis jsme poskytli první odhad metabolického toku přes Entner-Doudoroffovu dráhu na základě údajů změn růstu při zablokování této dráhy; je zatím obtížné provést experimentální ověření s pomocí izotopu 13C vzhledem k současným limitům detekce velmi nízkých koncentrací metabolitů v přístrojích hmotnostní spektrometrie. Nicméně jsme zjistili příliš mnoho nejasností (multifunkčnost enzymů a problémy s identitou enzymů Entner-Doudoroffovy dráhy), takže je obtížné anotovat nebo předpovědět rozsah možných metabolických a regulačních funkcí Entner-Doudoroffovy dráhy u Synechocystis.