Možnosti využití molekulárních metod pro studium populační genetiky raka říčního Astacus astacus

Abstract

Rak říční (Astacus astacus) je jeden ze dvou původních druhů raků žijících u nás, kteří jsou na celém našem území přísně chráněni, protože jsou označeni za kriticky ohrožený druh. V Evropě je to jeden z pěti původních druhů raků, zaznamenán organizací IUCN jako ohrožený druh, který potřebuje ochranný management. Jeho populace byly rapidně sníženy kvůli račímu moru, který přenášejí nepůvodní druhy raků ze Severní Ameriky, kteří byli v minulosti zavlečeni do Evropy a posléze i do České republiky. V minulosti byly izolovány a popsány mikrosatelitní markery pro raka říčního (Koiv a kol., 2008a). V rámci této práce bylo testováno použití těchto osmi mikrosatelitních markerů na vzorcích získaných z českých populací raka říčního. Testování jsme provedli na 53 vzorcích raků ze šesti populací. Testování vzorků bylo provedeno izolací DNA z tkáně třetí kráčivé končetiny pomocí DNA Lego Kitu. Následným ověřením izolátu DNA elektroforézou na agarózovém gelu. Testování teplotního cyklu PCR amplifikace vycházelo z původní publikace Koiva a kol. (2008a), následně byl PCR cyklus upravován podle kvality PCR produktů získaných v naší laboratoři. Jako nejvýhodnější byla zvolena teplota annealing primerů 60°C pro šest testovaných lokusů tj. Aas 3666, Aas 3115, Aas 790, Aas 1198, Aas 3950 a Aas 766, pro další dva lokusy Aas 2489 a Aas 3040 byla zvolena teplota annealingu 55°C. Výsledné produkty PCR byly testovány na agarózovém gelu a následně byly fragmentační analýzou na automatickém sekvenátoru Beckman Coulter CEQ8000 určovány délky PCR produktů v multiplexech složených z několika lokusů. V jednotlivých lokusech bylo v rámci našich 53 vzorků nalezeno od 1 do 13 alel ? jeden z lokusů byl monomorfní v rámci všech analyzovaných vzorků. Největší variabilitu ukázala moravská populace na Boskovické nádrži, průměrný počet alel na lokus 3,86, poté severočeská populace z Jaroměře 3,43 alel na lokus. Zelenohorská populace 3 alely na lokus a Světlohorská populace 2,57 alel na lokus. Nejnižší průměrný počet alel na lokus měla populace z Landštejna 2,43. Cílem této bakalářské práce bylo vypracovat literární rešerši o metodách molekulární biologie využívaných při studiu raků a zároveň ověřit možnost využití 8 dosud popsaných mikrosatelitních markerů pro raka říčního. V laboratorních podmínkách se podařilo úspěšně optimalizovat použití sedmi mikrosatelitních markerů z osmi popsaných. Tyto mikrosatelitní markery by měly být použitelné pro populační studie, a nebo pro určování rodičovství (otcovství) v reprodukčních experimentech. V rámci ověřování použitelnosti mikrosatelitních markerů byly vyhodnocovány i některé základní populační charakteristiky, optimalizace a testování použitelnosti mikrosatelitních markerů však bylo prováděno jen na velmi nízkém počtu vzorků, proto tyto charakteristiky mají pouze velmi omezenou vypovídací schopnost.