Výskyt mikrosporidií u hematologických a onkologických pacientů

Abstract

Mikrosporidie jsou intracelulární parazité patřící do říše hub. Existuje asi 1200 druhů mikrosporidií rozdělených do 150 rodů, pro člověka je nejvýznamnějších 14 druhů. Nejčastěji způsobuje infekce u člověka druh Enterocytozoon bieneusi, dále Encephalitozoon intestinalis Infekčním stádiem mikrosporidie je spora, což je oválný útvar umožňující infikování hostitele. Spora obsahuje tzv. pólové vlákno, které je vnějšími podmínkami vymrštěno do cytoplazmy hostitele a uvolňuje se obsah zvaný sporoplasma. Poté následuje vývoj mikrosporidie v hostiteli, který probíhá dvěma fázemi vývoje ? merogonií, při níž dochází k dělení plasmodia na meronty až do zaplnění buňky, a sporogonií, kdy se jednotlivé buňky osamostatňují a prochází jednotlivými stádii vývoje až do vzniku spory. Mikrosporidiózou se člověk může nakazit fekálně orálním přenosem, a to požitím kontaminované vody či špatně tepelně upraveného masa. Tento druh přenosu se nazývá horizontální. Druhým typem přenosu, který nebyl u lidí popsán, je vertikální (transplacentární přenos). Dále může být významný také zoonotický přenos. Člověk se může nakazit mikrosporidiózou od nejrůznějších druhů živočichů, kteří byli infikováni jednotlivými druhy mikrosporidií. Ohroženou skupinou jsou především pacienti se získanou primární imunodeficiencí, dále mohou být nakaženy děti, starší osoby, pacienti po transplantaci či cestovatelé. Mikrosporidie způsobují oportunní infekce, pro něž je charakteristické, že doprovázejí jiná primární onemocnění, například AIDS, virové či bakteriální onemocnění a mnoho dalších. Mezi nejčastější klinické projevy patří zejména průjem, dalšími příznaky mohou být i oční, plicní či svalové potíže. Cílem mé práce bylo zjistit přítomnost či nepřítomnost čtyř druhů mikrosporidií, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem, Encephalitozoon cuniculi a Enterocytozoon bieneusi, ve vzorcích stolice hematologických a onkologických pacientů a výsledky porovnat s již získanými výsledky. Celkem jsem nasbírala 45 vzorků stolice v období leden 2012 ? leden 2013. Vzorky byly odebírány do nesterilních uzavíratelných nádobek a zpracovány v laboratořích parazitologii v AV ČR v Českých Budějovicích. Následně jsem všechny vzorky zpracovala metodou barvení Calcofluor white a preparáty pozorovala pod mikroskopem Olympus IX 70. Hledala jsem oválné jasně modrobíle zářící spory mikrosporidií. Bylo nutné je odlišit od kvasinek. Další metodou zpracování byla molekulární diagnostika. Všech 45 vzorků jsem vyizolovala pomocí komerčního kitu PSP Spin Stool DNA kit (INVITEK). Principem izolace bylo rozbití spor a získání čisté DNA vhodné k dalšímu zpracování. Následně jsem provedla polymerázovou řetězovou reakci, což je metoda využívající rychlého zmnožení DNA založena na principu replikace nukleových kyselin. PCR probíhala v temocyklerech (BIO RAD, BIOER) po dobu dvou hodin. Amplifikace probíhala v opakujících se cyklech, složených ze tří základních kroků ? denaturace, hybridizace a elongace. Následujícím krokem byla gelová elektroforéza. Výsledek elektroforézy byl zobrazován pomocí transluminátoru, který byl propojen s počítačem. Podle délky fragmentů bylo určeno, zda se jedná o přítomnost jednoho ze čtyř výše uvedených druhů mikrosporidií ve vzorku. Jelikož se potvrdila přítomnost mikrosporidií, dalším krokem byla extrakce DNA z gelu. Vyizolovaná čistá DNA byla poté zaslána na sekvenaci. Celkem bylo na sekvenaci zasláno 9 fragmentů DNA. Posledním krokem byla analýza prováděná v biologickém centru AV ČR v Českých Budějovicích, která určila, o jaký genotyp se jedná. Byla potvrzena přítomnost druhu Encephalitozoon cuniculi, genotyp II u jednoho hematologického pacienta. Dále byla potvrzena přítomnost druhu Enteocytozoon bieneusi, genotyp D u dvou hematologických pacientů a u šesti onkologických pacientů.