Stanovení koagulačního faktoru VIII zhodnocení výsledků různých metod v závislosti na typu kauzální mutace v genu pro faktor VIII u pacientů s hemofilií A
Abstrakt
Hemostáza je pro život nezbytná, jedná se o schopnost organizmu zastavit krvácení a současně udržet tekutost krve v neporušeném cévním řečišti. Faktor VIII je nazýván antihemofilický globulin nebo antihemofilický faktor. Jedná se o plazmatický glykoprotein, tvořený dvěma nekovalentně spojenými řetězci. Z těžkého, složeného z domén A1-A2-B a z lehkého, složeného z domén A3-C1-C2. Aktivita FVIII se měří historicky dvěma způsoby a) jednofázovou metodou, kdy je směs plazmy s deficitem FVIII a pacientské plazmy testována pomocí testu APTT a v případě nedostatku FVIII v pacientské plazmě dochází k prodlužování času měření; b) dvoufázovou metodou, kdy v prvním kroku dochází k tvorbě FVIIIa a FXa a v druhé fázi se tvoří trombin a fibrin. Dvoufázová metoda je náročnější na provedení, a proto se postupně přestala používat. Po vyvinutí chromogenních substrátů byla tato metoda nahrazena metodou chromogenní, kdy v prvním kroku za přítomnosti FIXa, fosfolipidů a Ca2+ dojde k vytvoření FVIIIa a FXa a ve druhém kroku vznikne přidáním chromogenního substrátu žluté zabarvení. Deficit FVIII způsobuje závažné krvácivé onemocnění, hemofilii A.
Měření jsem prováděla od května do září 2013 v laboratoři pro poruchy hemostázy v Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze, kde jsem zaměstnaná. Vyšetřila jsem celkem 76 pacientů, hemofiliků A, kteří byli minimálně 8 dní bez jakékoli léčby nebo substituce. Pacientským vzorkům jsem přiřadila čísla, aby byla zajištěna anonymita pacientů. Pracovala jsem na automatickém koagulačním analyzátoru STA-R Evolution? od firmy Diagnostica Stago, a.s.a., který pracuje na principu fotometrie a chronometrie. Stanovovala jsem faktor VIII jednofázovou koagulační a dvoufázovou chromogenní metodou a porovnávala jsem výsledky. Genetická část byla zpracována v genetické laboratoři, která je součástí našeho oddělení.
Získané výsledky obou metod u 76 pacientů jsem zpracovala do tabulky i grafu. V souboru bylo 14 (18%) středně těžkých a 56 (74%) lehkých hemofiliků, dále 6 (8%) hemofiliků, kteří nesplňovali kritérium lehké hemofilie A, ale klinicky spadali mezi lehké hemofiliky. Na základě přijatého kritéria jsme zjistili, že 15 (20%) pacientů mělo poměr FVIII:C1st/FVIII:Chr nebo FVIII:Chr/FVIII:C1st 0,6, výrazně se tedy u nich lišili hodnoty FVIII stanovené jednofázově koagulačně a FVIII stanovené dvoufázově chromogenně. Celkem u 11 pacientů byla aktivita FVIII vyšší u jednofázové koagulační metody. Z toho u 3 pacientů FVIII:C1st byl dokonce na hranici normy, zatímco FVIII chromogenně byl v průměru 16%.
U 14 pacientů s rozdílnými výsledky se nám podařilo najít kauzální mutaci ve FVIII, u 1 pacienta jsme genetiku nemohli vyšetřit z důvodu chybějícího genetického materiálu. Mutace u pacientů s nižší aktivitou FVIII chromogenní dvoufázovou metodou byly soustředěny převážně do A3 domény, mutace u pacientů s nižší aktivitou FVIII jednofázovou koagulační metodou byly soustředěny v doméně A2.
Z prezentovaných výsledků vyplývá, že každý pacient s lehkou a středně těžkou hemofilií A by měl mít stanoven FVIII oběma metodami.