Detekce mutací spojovaných se zvýšeným výskytem nádorů prsu a vaječníků pomocí moderních metod molekulární biologie

Abstract

Karcinom prsu a vaječníků je jedno z nejčastějších maligních onemocnění žen v České republice a incidence nových diagnóz má tendence stoupat. Odhaduje se, že v 5 10 % případů těchto nádorů je příčinou patogenní mutace ve vysoce penetrantních tumorsupresorových genech BRCA1 nebo BRCA2. Hlavní funkcí těchto genů jsou opravy zlomů dvouvláknové DNA, kontrola buněčného dělení a spolupodílejí se i na regulaci transkripce a remodelaci chromatinu. Cílem této práce bylo shrnutí současných poznatků na dané téma, genové mutace, funkce genů BRCA1 a BRCA 2 a jejich souvislost s hereditárním karcinomem prsu a vaječníků, přehled možných metod detekce těchto mutací a zvláště také shrnutí českých studií o zabývajících se výskytem mutací BRCA1 a BRCA2 na území České republiky od počátku jejich testování v rámci preventivní i diagnostické péče. To poukázalo na silný efekt zakladatelských mutací. Mezi nejčastěji nalézanými mutacemi v České republice byly mutace c.5266dupC, c.181T>G a c.3700_3704del5 v genu BRCA1 a c.7913_7917del5 a c.8537_8538del2 v genu BRCA2. V experimentální části práce jsem se pokusila optimalizovat metodu PCR ARMS pro detekci bodové mutace c.5266dupC v genu BRCA1. Tato mutace patří mezi nejčastěji se vyskytující mutace nejen v České republice, ale i v Evropě. Cílem bylo optimalizovat metodu PCR ARMS v podmínkách laboratoře GENLABS s.r.o. V rámci optimalizace šlo především o výběr vhodného PCR mixu a úpravu teplotního profilu PCR, při kterém bude kvalita i kvantita výtěžku vizualizovaná pomocí gelové elektroforézy dostatečná pro prokázání přítomnosti či nepřítomnosti mutace u pacienta. V této části práce bylo cílem i praktické zvládnutí izolace DNA z periferní krve a bukálního stěru, příprava a provedení PCR reakce a detekce PCR produktů pomocí gelové elektroforézy. Nakonec se nám podařilo metodu optimalizovat pro dvě různé matrice, pro izolát DNA a periferní krev. Pro bukální stěr se metodu podařilo optimalizovat pouze částečně. Při postupném zvyšování teploty annealingu začínající na teplotě 55 °C, jsme nejlepších výsledků dosáhli při teplotě 65,5 ° za použití kitu gb Basic PCR Master Mix od firmy Generi Biotech. Tato optimalizace může v budoucnu umožnit použití metody pro cílenou detekci mutace c.5266dupC v genu BRCA1 v rámci rutinní praxe v laboratoři.