Sekvenování genu ORMDL3
Abstrakt
Hlavním tématem předkládané práce je analýza sekvencí genu ORMDL3, který je identifikován jako potenciální rizikový faktor řady onemocnění, přičemž nejdiskutovanějším z nich je dětské astma. Tento gen je členem skupiny genů ORMDL, kódující transmembránové proteiny ukotvené v endoplazmatickém retikulu. ORMDL3 je u člověka lokalizován na chromozomu 17, v oblasti 17q21.1.
V teoretické části práce jsou blíže specifikována autoimunitní onemocnění, na jejichž vzniku a rozvoji se mutace v genu ORMDL3 do určité míry podílí. Těmito onemocněními je již zmíněné astma, dále Crohnova choroba, revmatoidní artritida, inzulin dependentní diabetes mellitus a primární biliární cirhóza. Následně je zde popsána metoda Sangerova sekvenování, pomocí níž byly vzorky sekvenovány, a novodobá metoda NGS.
Praktická část práce je zaměřena na přípravu vzorků pro Sangerovo sekvenování
a hodnocení sekvenačních dat. K amplifikaci požadovaného úseku pro sekvenační reakci byla použita metoda PCR. Takto bylo připraveno 20 anonymizovaných vzorků DNA.K sekvenování firmou Genseq s.r.o. bylo odesláno 15 vzorků. Dále bylo hodnoceno 20 poskytnutých vzorků, z nichž 10 bylo od dětí z Českobudějovicka a 10 od dětí z Karvinska. Také tyto vzorky byly anonymizovány.
Pro analýzu sekvencí jednotlivých vzorků DNA byl využit volně přístupný program BioEdit a databáze NCBI. Sekvence byly přečteny z obou stran (forward a reverse), nalezené mutace identifikovány a výsledná data zaznamenána do grafů. Po přečtení vlastních sekvencí byla u 5 z 15 vzorků přítomna heterozygotní mutace. Stejná mutace byla přítomna také v poskytnutých sekvencích, konkrétně u 8 z 10 Českobudějovických a 3 z 10 Karvinských. Tato mutace není v databázi NCBI dosud popsána.